![Metodyka pobierania prób materiału szkółkarskiego – malina, jeżyna [wirusy]](edc_media/Structure/Item-2336/ArticleImage/820x280mCROPcFEFFFE.jpg)
Metodyka pobierania prób materiału szkółkarskiego do testów laboratoryjnych na obecność wirusów: Malina – Rubus idaeus L., Jeżyna – Rubus fruticosus i inne gatunki Rubus ssp.
Wirusy odpowiednio dla danego gatunku:
- Wirus mozaiki jabłoni – Apple mosaic virus (ApMV)
- Wirus nekrozy jeżyny – Blackberry necrosis virus (BRNV)
- Wirus mozaiki ogórka – Cucumber mosaic virus (CMV)
- Wirus pstrości liści maliny – Raspberry leaf mottle virus (RLMV)*
- Wirus plamistości liści maliny – Raspberry leaf blotch virus (RLBV)
- Wirus chlorozy nerwów liści maliny – Raspberry vein chlorosis virus (RVCV)
- Wirus żółtaczki nerwów liści maliny – Rubus yellow net virus (RYNV)
- Wirus krzaczastej karłowatości maliny – Raspberry bushy dwarf virus (RBDV)
* Raspberry leaf mottle virus (RLMV), Raspberry mottle virus (RMoV) oraz Raspberry leaf spot virus (RLSV) są szczepami tego samego wirusa i przyjęto dla nich nazwę Raspberry leaf mottle virus (W.J. McGavin, S.A. MacFarlane. 2010. Annals of Applied Biology, 156: 439–448)
Termin pobierania prób
Materiał roślinny powinien być uznany za wolny od wirusów na podstawie wyników oceny wizualnej. Pobieranie prób i badania laboratoryjne przeprowadza się w przypadku wątpliwości dotyczących obecności wirusów. Próby do testów na obecność ApMV, BRNV, CMV, RLMV, RLBV, RVCV, RYNV i RBDV należy pobierać wiosną (VVI) przed nastaniem długotrwałych wysokich temperatur powietrza.
Wybór tkanki/części rośliny do testowania
Dla roślin gatunków Rubus spp. wykonuje się testy na obecność CMV, BRNV, RYNV i RBDV. Dla roślin gatunków R. idaeus, R. fruticosus wykonuje się testy na obecność ApMV.
Dla roślin gatunku R. idaeus wykonuje się testy na obecność RLMV, RLBV i RVCV. (źródło: Certification scheme for Rubus. EPPO Standard PM 4/10 (2), 2009. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 39, 271-277)
Do testów na obecność wirusów zalecane jest wykorzystywanie młodych liści pobranych z fragmentu pędu do 2/3 długości od nasady.
Sposób pobierania prób
Przy pobieraniu próbek należy kierować się następującymi ogólnymi zasadami:
- Jedna próbka powinna pochodzić z jednej rośliny, oznakowanej w sposób umożliwiający jej identyfikację (w dalszej części omówiono odstępstwa od tej reguły).
- Wskazane jest oznaczenie (zaetykietowanie) roślin, z których pobrano próbki, chyba, że identyfikacja jest możliwa na podstawie istniejącego oznakowania lub szczegółowego planu nasadzenia.
- Próby należy pobierać do trwale oznakowanych foliowych torebek, zabezpieczając przed nadmiarem wilgoci i wysychaniem (groźniejszy jest nadmiar wilgoci niż wysychanie). Torebki mogą być otwarte tylko, jeżeli będą transportowane bezpośrednio do laboratorium w sposób, który uniemożliwi zamieszanie prób. W każdym innym przypadku próby należy zabezpieczyć przez zamknięcie torebek. Na czas zbierania i transportu, próby należy zabezpieczyć przed nadmiernym nagrzewaniem przez zacieniowanie. W przypadku wyższych temperatur (powyżej 25°C) zaleca się umieszczenie prób w tzw. lodówce turystycznej, pojemniku styropianowym albo "torbie na mrożonki" z wkładem chłodzącym. Nie dopuszczać do zamrożenia prób! Po dostarczeniu do laboratorium próby należy umieścić w chłodzie (+4ºC do +10ºC). Próbki mogą być przechowywane w lodówce (chłodni) kilka do kilkunastu dni.
- Próba powinna być reprezentatywna dla rośliny, tzn.:
- z roślin 4-letnich i młodszych, próbka pobierana jest z maksymalnie czterech różnych pędów, po dwa do czterech liści (pąków) lub mniej tak, aby nie uszkodzić badanej rośliny
- z roślin 5-letnich i starszych próbka pobierana jest z czterech różnych pędów (z czterech stron krzewu), po dwa do czterech liści z pominięciem liści najstarszych i najmłodszych.
- . Liście należy pobierać z dolnej i środkowej części pędów
- Jeżeli na liściach występują chlorotyczne plamy, należy w pierwszym rzędzie pobrać próbki liści wykazujących objawy chorobowe.
- Przy pobieraniu prób należy sporządzić i dołączyć do prób pisemną informację.
UWAGA: Przy pobieraniu prób w mateczniku sadzonek, identyfikacja pojedynczej rośliny może być utrudniona. W takim przypadku należy trwale oznakować 1 metr bieżący, z którego jako jedną próbę należy z każdej rośliny pobrać do testów po dwa w pełni wykształcone liście z pominięciem liści najstarszych i najmłodszych. W przypadku stwierdzenia wirusa należy usunąć rośliny z badanego metra i po jednym metrze z każdej strony (łącznie 3 metry bieżące rzędu).
Metoda laboratoryjna weryfikacji obecności wirusów
Do wykrywania CMV, ApMV i RBDV należy stosować test ELISA.
Do wykrywania BRNV, RLMV, RLBV, RVCV i RYNV należy stosować test RT-PCR, w którym reakcja PCR poprzedzona jest reakcją odwrotnej transkrypcji (ang. reverse Data publikacji (umieszczenia na stronie internetowej): 31.05.2019 strona 4 / 5 transcription, RT) polegającej na przepisaniu sekwencji mRNA na tzw. komplementarne DNA (cDNA).
Do izolacji kwasów nukleinowych można stosować różne metody np. oparte na wykorzystaniu złoża krzemionkowego (tzw. metoda „silica capture”) opisane m.in. w publikacji 1 i 2 lub gotowe zestawy np.: RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Opis zasad i etapów reakcji RT-PCR można znaleźć w wielu powszechnie dostępnych publikacjach naukowych np. cytowanych poniżej lub w materiałach edukacyjnych np. www.e-biotechnologia.pl. W każdym przypadku należy stosować się do zaleceń producenta zestawu odczynników do reakcji RT-PCR.
- źródło: inhort.pl
